Neben den klassischen mikrobiologischen Methoden wie Mikroskopie oder Anzucht unter bestimmten Bedingungen mit Selektionsmedien, sowie biochemischen Methoden hat sich in den letzten Jahren eine molekularbiologische Methodik durchgesetzt, die sogenannte 16S (für Bakterien), bzw. ITS (für Pilze, Hefen und z.T. Pflanzen) Sequenzierung.
Der Vorteil dieser Methode gegenüber den klassischen mikrobiologischen und biochemischen Methoden ist, dass auch nicht kultivierbare Organismen bestimmt werden können, ebenso ist eine Identifizierung von pathogenen Organismen ohne Ansteckungsrisiko für die Bearbeiter möglich. Darüber hinaus entfällt, im Vergleich zu den klassischen Identifikationsmethoden durch Selektionsmedien die Inkubationszeit, so dass die 16S-Analytik deutlich schneller Ergebnisse liefern kann.Alle Lebewesen tragen die Erbinformationen in Form von DNA (Desoxyribonukleinsäure) und RNA (Ribonukleinsäure) in sich. Um Lebewesen zu bestimmen, wird ein kleiner Teil der Erbinformation sequenziert und miteinander verglichen. Bei den Bakterien und Archaeen liegt die zu sequenzierende Region auf der kleinen Untereinheit der Ribosomen. Ribosomen werden aufgrund ihres Sedimentationsverhaltens, also letztendlich nach Größe bzw. Gewicht klassifiziert und in der Einheit Svendberg (S) angegeben.
In den Ribosomen erfolgt die Translation der Nukleinsäuren (Proteinbiosynthese), d.h. Proteine bzw. Aminosäuren werden hergestellt. Ribosomen bestehen aus DNA und Proteinen, sie kommen in allen Zellen vor, so dass die ribosomale DNA (rDNA) leicht zu extrahieren ist.
Aufgrund der relativ geringen Größe der rDNA wird nur eine geringe Menge für die PCR benötigt. Das Target-Gen ist sehr variabel, so dass es sich zwischen den Gattungen und Arten der Bakterien unterscheidet. Diese hochvariable Regionen sind von stark konservierten Bereichen flankiert, d.h. diese sind zwischen den Arten und Gattungen (relativ) ähnlich. So ist es möglich mit bestimmten Primersets die variablen Bereiche mittels PCR zu amplifizieren und zu sequenzieren.
Um nun möglichst viele unterschiedliche Bakterien in einer PCR zu amplifizieren, benötigt man eine Mixtur von unterschiedlichen Primern. Die genaue Zusammensetzung ist das Firmengeheimnis, da hiervon der Erfolg der PCR wesentlich abhängt.
Bei der Domäne Eukaryoten, insbesondere bei Hefen und Pilzen wird die sogenannte ITS-Region sequenziert, diese Abkürzung steht für Internal Transcribed Spacer. Zwischen der 18S und 28S-Region finden sich zwei dieser ITS- Regionen, welche sich aufgrund der ähnlichen Eigenschaften zur 16S-Region ebenfalls zur Identifikation nutzen lassen.